لوتئولين، شوری و ترشحات بذر ژن گرهزايیدر باکتری با استفاده تأثير از ارزيابی فعاليت آنزيم چیست ؟

Question

لوتئولين، شوری و ترشحات بذر بر بيان ژن گرهزايیدر باکتری با استفاده تأثير از ارزيابی فعاليت آنزيم چیست ؟

حسین برخورداری · Answer

لوتئولین، شوری و ترشحات بذر بر بیان ژن گرهزاییدر باکتری با استفاده تأثیر از ارزیابی فعالیت آنزیم چیست ؟

فلاونوئیدها نقش مهمی را به عنوان سیگنال های مولکولی در تشکیل گرهها توسط ریزوبیومهای همزیست بازی میکنند. لوتئولین یکی از مهمترین فلاونوئیدها است که توسط بذرهای در حال جوانهزنی یونجه ترشح میشود. همچنین به نظر میرسد سطح شوری بالا بدون حضور فلاونوئید موجب افزایش بیان ژنهای گرهزایی میشود. بنابراین، در این آزمایش S تأثیر لوتئولین، ترشحات بذر و شوری بر بیان ژن گرهزایی دو سویه حساس و مقاوم به شوری . با استفاده از meliloti Escherichia از باکتری lacZ و ژن nodAپلاسمید حامل پروموتور β و از طریق فعالیت آنزیم coli - مورد galactosidase را افزایش داد که nodAبررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که پیش تیمار باکتریها با لوتئولین و ترشحات بذر بیان ژن mM تأثیر ترشحات بذر بر بیان ژن بیشتر از لوتئولین بود. همچنین نتایج نشان داد که سطح شوری بالا 411 و 311 بدون حضور فلاونوئید منجر به بیان ژن گرهزایی شد و در شرایطی که شوری بالا و القاکنندهها به طور همزمان وجود بیشتر بود. به نظر میرسد ریزوبیومها از یک مکانیسم جایگزین برای بهبود گرهزایی در شرایط nodAداشت، بیان ژن تنش استفاده میکنند.

همزیستی بین لگومها و ریزوبیومها برای تشکیل گرههای تثبیت Guasch ( کننده نیتروژن ضروری است -Vidal et al., ). وجود این همزیستی نیاز به هماهنگی بیان ژنهای 2013 گیاهی و باکتری دارد که این هماهنگی از طریق تبادل سیگنال (Spaink, 2000; Jones ( های مولکولی انجام میشود et . بررسی توالی نوکلئوتیدی نشان داده است که ژنهای al., 2007 باکتریایی مسئول گرهزایی و تثبیت نیتروژن در ریزوبیومها و (MacLean قرار دارد (pSym) سینوریزوبیومها روی مگاپلاسمید . ژنهای گرهزایی به سه et al., 2007; Jones et al., 2007) که nodABC ) ژنهای معمول گرهزایی ᵢ دسته تقسیم میشوند: ( ژنهای اساسی گرهزایی هستند که این ژنها در بین گونههای (Ja مختلف ریزوبیومی به شدت حفاظت شده هستند cobs et ) ژنهای اختصاصی ᵢᵢ( .al., 1985; Debelle et al., 1986)
و )... که طیف میزبان و nodPQ ،nodG ،nodH ،nodFE(میزبان ( تشکیل گرهها را تعیین میکنند 2 و تناوب 1میزان Horvath et al., 1986; Debelle et al., 1986; Schwedock and Long, nodD ) یک خانواده از ژنهای تنظیم کننده ᵢᵢᵢ و ( 1989) (Spaink, 2000). اولین سیگنال هایی که بین گیاه میزبان و سینوریزوبیوم همزیست مبادله میشود ترکیبات فلاونوئیدی هستند که توسط - برای بیان ژن، گیاهان تولید میشوند که علاوه بر وظایف دیگر های گرهزایی ضروری میباشند ( Mulligan and Long, 1985) . (Chen میشود nodD فلاونوئیدها منجر به بیان ژن گرهزایی et که توسط ترکیبات ترشحات ریشه NodD .پروتئین al., 2005) متصل شده و nodABC فعال میشود به اپرونهای ژنهای منجر به بیان آنها میشود ( Englesberg and Wilcox, 1974) . بیان ژن )LCOs3( فاکتورها Nod منجر به بیوسنتز nod های  میشود که توسط باکتریها ترشح میشود و فرایند ادامه مییابد .(Jones تا گرهها تشکیل شود et al., 2007) 1 و فلاونوئیدها خاص nodD به نظر میرسد تعامل بین (30,40,5,7 باشد. برای مثال، لوتئولین -tetrahydoxyflavone) Sinorhizobium در nod ویژه القای ژنهای meliloti (Peck et (5,7,40 ، ناریجنین al., 2006) -trihy-droxyflavanone) Sinorh در nod القاکننده ژنهای izobium leguminosarum bv. viciae (Zaat 7,40 و et al., 1988) -dihydroxyflavone فعال S در nod کننده ژنهای . leguminosarum bv. trifolii Bradyrhizobium و (Zaat میباشند sp. et al., 1988, 1989). شواهدی وجود دارد که استفاده از القاکننده های خارجی در سینوریزبیومها و درنتیجه گرهزایی را در nod بیان ژنهای برخی از گونههای لگومها، افزایش میدهد. برای مثال، استفاده (Kapulnik از لوتئولین منجر به افزایش گرهزایی در یونجه شد Bradyrhizobium . پیشتیمار et al., 1987) با japonicum جنستین گرهزایی و عملکرد دانه را در سویا ( Glycine max) S. leguminosarum و تلقیح (Zhang and Smith, 1996) با هسپرتین و نارینجنین گرهزایی و تجمع ماده خشک در نخود و (Begum عدس افزایش دادند . افزایش گرهزایی et al. 2001) لوبیا توسط یا Sinorhizobium etli با Sinorhizobium tropici (Hungria and Phillips, مشاهده شد 2 استفاده از کورستین Abd . همچنین، 1993) -Alla نشان داد که استفاده از (2011) ایزوفلاونوئیدها در محلول غذایی به طور معنیداری گره زایی در لوبیا را افزایش میدهد. Nodهمچنین، تحقیقات نشان داده است که تولید فاکتورها به شدت تحت تأثیر محیط رشد باکتری قرار میگیرد. فاکتورها توسط Nodاین حقیقت که عوامل محیطی بر تولید Laeremans ریزوبیومها تأثیر میگذارد برای اولین بار توسط گزارش شد. در شرایط تنش مانند (1998) and Vanderleyden S. tropici اسیدیته یا شوری بالا وقتی تحت تأثیر CIAT899 فاکتورهای متفاوت بیشتر Nod فلاونوئید اپیجنین قرار گرفت (Moron با غلظتهای بالاتری نسبت به شرایط عادی تولید شد . در آزمایش دیگری شوری et al., 2005; Estevez et al., 2009) شد. nodبالا بدون استفاده از فلاونوئیدها، منجر به بیان ژن در غیاب NaCl فاکتورهای تولید شده تحت شرایط تنش Nod فلاونوئید از لحاظ بیولوژیکی فعال بودند به طوری که در شرایط نرمال بدون تنش روی ریشه لوبیا شبه گره ایجاد کردند
1. specific 2. quercetin
(Guasch -.) در مقایسه با مسیر کلاسیک Vidal et al., 2013 فاکتور توسط فلاونوئیدها، این مکانیسم جایگزین Nodتولید فاکتورها ممکن است در شرایط تنش مهم باشد Nodتولید (Guasch -Vidal et. al., 2013.) بنابراین هدف از این آزمایش بررسی تأثیر شوری و القاکنندههای خارجی لوتئولین و ترشحات بذر بر بیان ژن گرهS ( زایی سینوریزوبیوم ) بود. برای این منظور از . meliloti – پلاسمید حاوی lacZ P استفاده شد؛ که در آن پروموتور nodA lacZ قرار دارد. ژن lacZ در بالادست ژن بدون پروموتور nodA β از باکتری اشرشیاکولی تهیه میشود که آنزیم -galactosidase را کد میکند، این آنزیم لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تجزیه میکند. برای انجام آزمایش پلاسمید باید وارد باکتریهای Escherichia coli ریزوبیوم شود که برای آن از روشهای ( Ditta et al., 1980 ) Gard ( الکتروپوریشن et al., 1999; freeze )و Hayashi et al., 2000 -thaw (Vincze and Bowra, ) استفاده میشود که در این آزمایش از روش 2006 الکتروپوریشن استفاده شد. الکتروپوریشن یک روش سریع، ساده با کارایی بالا است که در این روش از میدان الکتریکی با شدت بالا در یک مدت کوتاه استفاده میشود که منجر به نفوذپذیری قابل برگشت در غشای سلول میشود تا ورود ماکرومولکولهایی Garg ( مانند پلاسمید را تسهیل کند et al., 1999). مواد و روشها سینوریزوبیوم تحت تاثیر لوتئولین، nodA بررسی بیان ژن β ترشحات بذر و شوری با استفاده از روش -galactosidase pMPA221 انجام شد. در این روش از پلاسمید (Miller, 1972) Maria Curie (تهیه شده از دانشگاه - لهستان Skłodowska Anna دکتر PnodA ) که حاوی Skorupska (پروموتور ژن –lacZ از باکتری اشرشیاکولی) lacZ و ژن بدون پروموتور A گرهزایی β آنزیم lacZاست، استفاده شد. - را کد میکند، galactosidase این آنزیم لاکتوز را به گلوکز و گالاکتوز تجزیه میکند. برای انجام آزمایش ابتدا پلاسمید باید وارد باکتریهای سینوریزوبیوم میشد که این کار با استفاده از الکتروپوریشن 11 (تقریبا 31µlانجام شد. در این روش به ) باکتری مستعد 5× 8 Garg ( سینوریزوبیوم ) از 51ng (تقریباً 5µl ،) et al., 1999 دقیقه روی یخ قرار داده شد. باکتری 31پلاسمید اضافه شد و ها 51µF و Ω211 ،1811Vبا استفاده از دستگاه الکتروپوریشن در الکتروپوریت شدند (پژوهشگاه ملی و مهندسی ژنتیک و زیست در شیکر در دمای YEM ساعت در محیط 24 فناوری). سپس ساعت باکتریها به 24 درجهسانتیگراد قرار داده شد. بعد از 28 محیط جامد تتراسایکلین میباشد) بود منتقل شد. بعد از دو تا سه روز کلونیها به محیط تازه منتقل شدند. باکتری های حاوی پلاسمید در این روش مورد استفاده قرار گرفت. حاوی YEM سینوریزوبیوم دارای پلاسمید در 5 تا 3 درجه سانتیگراد در شیکر به مدت 28تتراسایکلین در OD روز رشد داده شدند تا رسید سپس با 1/4 آنها به 620 OD استفاده از محیط رشد تازه رسانده شد. 1/1 آنها به 620 Sigma ( باکتریها در تیوبها توزیع شدند و مقداری لوتئولین ) به آنها اضافه شد که غلظت نهایی این Aldrich, L9283 بود. 111µM و 15 ،51 ،31 ،21 ،11 ،5القاکننده در فالکونها محلول لوتئولین با اتانول تهیه شد. شاهد فاقد القاکننده بود و از اتانول به عنوان کنترل منفی استفاده شد. در آزمایشهای ،21 ،1 به تیوبها اضافه شد که شوریهای NaClشوری مقداری میلیمولار به دست آمد و در 411 ،311 ،211 ،111 ،51 تیمارهای مربوط به ترشحات بذر مقداری از محلول ترشحات ،11 ،5 ،2/5 ،1 بذر به تیوبها اضافه شد که غلظتهای نهایی درصد به دست آمد. در تیمارهای همزمان 51 و 41 ،25 ،15 شوری و لوتئولین یا شوری و ترشحات بذر، در تیوبها هر دو تیمار شوری و لوتئولین یا شوری و ترشحات بذر اعمال شد. در این تیمارها در تیوبهایی که حاوی غلظتهای مختلف شوری بودند، ترشحات بذر یا لوتئولین اعمال شدند. با توجه به نتایج میکرومولار، به 111 و 51% و لوتئولین 51اولیه از ترشحات بذر دلیل اینکه بیشترین تأثیر را داشتند، به ترتیب در باکتری های مقاوم و حساس به شوری استفاده شد. سپس، تیوبها به مدت درجه سانتیگراد در شیکر قرار داده 28 ساعت در دمای 18 β شد. سپس آزمایش فعالیت انجام شد.

منبع : تحقیقات اب و خاک ایران